Técnicas de secuenciación masiva.

В рамках концепции массивного секвенирования или NGS (секвенирования следующего поколения) существует множество очень сложных диагностических методов, которые значительно расширили диагностические возможности в детской неврологии. Мы можем классифицировать их по нескольким критериям.

Исторический критерий (поколение).

19955111 {19955111:I5ZMYFCS} 1 Ванкувер 50 по умолчанию 2240 https://neuropediatoolkit.org/wp-content/plugins/zotpress/

%7B%22status%22%3A%22success%22%2C%22updateneeded%22%3Afalse%2C%22instance%22%3Afalse%2C%22meta%22%3A%7B%22request_last%22%3A0%2C%22request_next%22%3A0%2C%22used_cache%22%3Atrue%7D%2C%22data%22%3A%5B%7B%22key%22%3A%22I5ZMYFCS%22%2C%22library%22%3A%7B%22id%22%3A19955111%7D%2C%22meta%22%3A%7B%22creatorSummary%22%3A%22Gupta%20and%20Verma%22%2C%22parsedDate%22%3A%222019%22%2C%22numChildren%22%3A1%7D%2C%22bib%22%3A%22%26lt%3Bdiv%20class%3D%26quot%3Bcsl-bib-body%26quot%3B%20style%3D%26quot%3Bline-height%3A%201.35%3B%20%26quot%3B%26gt%3B%5Cn%20%20%26lt%3Bdiv%20class%3D%26quot%3Bcsl-entry%26quot%3B%20style%3D%26quot%3Bclear%3A%20left%3B%20%26quot%3B%26gt%3B%5Cn%20%20%20%20%26lt%3Bdiv%20class%3D%26quot%3Bcsl-left-margin%26quot%3B%20style%3D%26quot%3Bfloat%3A%20left%3B%20padding-right%3A%200.5em%3B%20text-align%3A%20right%3B%20width%3A%201em%3B%26quot%3B%26gt%3B1.%26lt%3B%5C%2Fdiv%26gt%3B%26lt%3Bdiv%20class%3D%26quot%3Bcsl-right-inline%26quot%3B%20style%3D%26quot%3Bmargin%3A%200%20.4em%200%201.5em%3B%26quot%3B%26gt%3BGupta%20N%2C%20Verma%20VK.%20Next-Generation%20Sequencing%20and%20Its%20Application%3A%20Empowering%20in%20Public%20Health%20Beyond%20Reality.%20In%3A%20Arora%20PK%2C%20editor.%20Microbial%20Technology%20for%20the%20Welfare%20of%20Society%20%5BInternet%5D.%20Singapore%3A%20Springer%3B%202019%20%5Bcited%202021%20May%202%5D.%20p.%20313%26%23x2013%3B41.%20%28Microorganisms%20for%20Sustainability%29.%20Available%20from%3A%20%26lt%3Ba%20class%3D%26%23039%3Bzp-ItemURL%26%23039%3B%20href%3D%26%23039%3Bhttps%3A%5C%2F%5C%2Fdoi.org%5C%2F10.1007%5C%2F978-981-13-8844-6_15%26%23039%3B%26gt%3Bhttps%3A%5C%2F%5C%2Fdoi.org%5C%2F10.1007%5C%2F978-981-13-8844-6_15%26lt%3B%5C%2Fa%26gt%3B%26lt%3B%5C%2Fdiv%26gt%3B%5Cn%20%20%26lt%3B%5C%2Fdiv%26gt%3B%5Cn%26lt%3B%5C%2Fdiv%26gt%3B%22%2C%22data%22%3A%7B%22itemType%22%3A%22bookSection%22%2C%22title%22%3A%22Next-Generation%20Sequencing%20and%20Its%20Application%3A%20Empowering%20in%20Public%20Health%20Beyond%20Reality%22%2C%22creators%22%3A%5B%7B%22creatorType%22%3A%22author%22%2C%22firstName%22%3A%22Nidhi%22%2C%22lastName%22%3A%22Gupta%22%7D%2C%7B%22creatorType%22%3A%22author%22%2C%22firstName%22%3A%22Vijay%20K.%22%2C%22lastName%22%3A%22Verma%22%7D%2C%7B%22creatorType%22%3A%22editor%22%2C%22firstName%22%3A%22Pankaj%20Kumar%22%2C%22lastName%22%3A%22Arora%22%7D%5D%2C%22abstractNote%22%3A%22Next-generation%20sequencing%20has%20the%20ability%20to%20revolutionize%20almost%20all%20fields%20of%20biological%20science.%20It%20has%20drastically%20reduced%20the%20cost%20of%20sequencing.%20This%20allows%20us%20to%20study%20the%20whole%20genome%20or%20part%20of%20the%20genome%20to%20understand%20how%20the%20cellular%20functions%20are%20governed%20by%20the%20genetic%20code.%20The%20data%20obtained%20in%20huge%20quantity%20from%20sequencing%20upon%20analysis%20gives%20an%20insight%20to%20understand%20the%20mechanism%20of%20pathogen%20biology%2C%20virulence%2C%20and%20phenomenon%20of%20bacterial%20resistance%2C%20which%20helps%20in%20investigating%20the%20outbreak.%20This%20ultimately%20helps%20in%20the%20development%20of%20therapies%20for%20public%20health%20welfare%20against%20human%20pathogen%20and%20diagnostic%20reagents%20for%20the%20screening.%20This%20chapter%20includes%20the%20basic%20of%20Sanger%5Cu2019s%20method%20of%20DNA%20sequencing%20and%20next-generation%20sequencing%2C%20different%20available%20platforms%20for%20sequencing%20with%20their%20advantages%2C%20and%20limitations%20and%20their%20chemistry%20with%20an%20overview%20of%20downstream%20data%20analysis.%20Furthermore%2C%20the%20breadth%20of%20applications%20of%20high-throughput%20NGS%20technology%20for%20human%20health%20has%20been%20discussed.%22%2C%22bookTitle%22%3A%22Microbial%20Technology%20for%20the%20Welfare%20of%20Society%22%2C%22date%22%3A%222019%22%2C%22originalDate%22%3A%22%22%2C%22originalPublisher%22%3A%22%22%2C%22originalPlace%22%3A%22%22%2C%22format%22%3A%22%22%2C%22ISBN%22%3A%22978-981-13-8844-6%22%2C%22DOI%22%3A%2210.1007%5C%2F978-981-13-8844-6_15%22%2C%22citationKey%22%3A%22%22%2C%22url%22%3A%22https%3A%5C%2F%5C%2Fdoi.org%5C%2F10.1007%5C%2F978-981-13-8844-6_15%22%2C%22ISSN%22%3A%22%22%2C%22language%22%3A%22en%22%2C%22collections%22%3A%5B%2284TR57I6%22%5D%2C%22dateModified%22%3A%222026-07-15T22%3A39%3A25Z%22%7D%7D%5D%7D

1.
Gupta N, Verma VK. Next-Generation Sequencing and Its Application: Empowering in Public Health Beyond Reality. In: Arora PK, editor. Microbial Technology for the Welfare of Society [Internet]. Singapore: Springer; 2019 [cited 2021 May 2]. p. 313–41. (Microorganisms for Sustainability). Available from: https://doi.org/10.1007/978-981-13-8844-6_15

Los métodos de secuenciación de segunda generación se basan en el principio del «дробовое секвенирование«, y requieren la fragmentación del DNA en estudio, pero lamentablemente la longitud de las lecturas es corta (short-read sequencing), por lo que determinados tipos de mutaciones no son identificables (STR, delecciones o duplicaciones, etc.).
Методы третьего и четвертого поколений были разработаны с целью преодоления этого ограничения, поэтому их еще называют длинное считывание последовательности.

Тип захвата.

Используемый тип захвата имеет фундаментальное клиническое значение, поскольку он будет определять почти больше, чем тип используемой технологии, клинические решения, которые мы должны принять, если окончательные диагностические результаты не будут получены.

Генная панель.

Он предполагает анализ максимум примерно 200 генов.
Он позволяет изучать заболевания с генотипической изменчивостью, но требует выработки предварительной гипотезы (сначала фенотипический подход).
Это существенно ограничивает количество выводов, не связанных с исследуемой проблемой, а также вариантов неопределенного значения.

Клиническое/целевое/исследование секвенирования экзома менделиомы

Он состоит из анализа всех кодирующих регионов (кодирующие регионы составляют 1% генома и аккумулируют 80% известных патогенных вариантов), для которых ранее были описаны гены, связанные с заболеванием (эти гены с неизвестной функцией не предоставляют клинически значимой информации, даже когда мы обнаруживаем патогенные варианты).
Он позволяет проводить исследования без выдвижения предварительной гипотезы (генотипический подход) и предполагает анализ более 4000 генов (в зависимости от развития научных знаний, которые в настоящее время находятся в стадии разработки). ОМИМ уже превышает 6000), что эквивалентно размеру около 10 Мб.
Это позволяет обнаруживать фланкирующие некодирующие варианты (варианты в 3'- или 5'-UTR).
Он не позволяет использовать в исследовательских целях гены с неизвестной функцией, поскольку они не включены, а также не позволяет проводить повторный анализ указанных генов, поскольку их последовательность не получена.
Повторный анализ данных через несколько лет может представлять интерес, поскольку количество изученных генов означает, что патогенные варианты, которые будут обнаружены в будущем, возможно, не будут описаны.
Он предлагает хороший баланс между риском вариантов неопределенной значимости и диагностической рентабельностью без увеличения экономических и трудовых затрат на анализ всего экзома или генома.

Исследование секвенирования экзома.

Он позволяет выявлять варианты в белок-кодирующих областях как в генах, уже связанных с патологией, так и в тех, в которых она не описана, поэтому предполагает анализ более 20 000 генов, что эквивалентно размеру около 100 Мб.
Это позволяет обнаруживать фланкирующие некодирующие варианты (варианты в 3'- или 5'-UTR).
Это позволяет формулировать исследовательские гипотезы и открывать новые заболевания и неизвестные функции генов, которые в настоящее время еще недостаточно хорошо описаны.
Это позволяет провести повторный анализ данных в поисках новых знаний через несколько лет с момента проведения исследования без необходимости получения новых образцов.
Это существенно увеличивает стоимость как в экономическом плане, так и в плане работ.
Это значительно увеличивает вероятность получения результатов неопределенного значения и неожиданных результатов, поэтому рекомендуется проводить исследование втроем, чтобы автоматически сопоставлять информацию о семье.

Исследование секвенирования генома.

Это позволяет обнаруживать все варианты в областях, кодирующих белок.
Он позволяет обнаружить все некодирующие варианты (глубокие интроники, варианты в 3'- или 5'-UTR).
Это позволяет обнаруживать варианты в регуляторных регионах (энхансеры, сайленсеры, инсуляторы).
Это позволяет обнаруживать небольшие делеции или дупликации (одиночный экзон).
Это позволяет обнаруживать структурные варианты (транслокации, инсерции, делеции и их точки останова).
Это самый затратный процесс в экономическом и трудовом отношении.
Это значительно увеличивает вероятность получения результатов неопределенного значения и неожиданных результатов, поэтому рекомендуется проводить исследование втроем, чтобы автоматически сопоставлять информацию о семье.
Это примерно эквивалентно размеру 3 ГБ.

Puedes consultar los distintos tipos de captura comercializados para conocer su extensión.

Тип технологии секвенирования

Интересно знать, что методы, использующие амплификацию, могут вызывать систематическую ошибку при анализе последовательностей, богатых GC, из-за трудностей, с которыми сталкивается ПЦР в этих регионах.

https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-981-13-8844-6_15

https://info.abmgood.com/next-generation-sequencing-ngs